对毒品成瘾的老鼠消除奖赏记忆的预防复吸实验
来源: 毒品检验网   发布时间: 2020-02-04 13:05   45 次浏览   大小:  16px  14px  12px
吸毒成瘾人员的大脑奖赏记忆是导致复吸毒品的重要因素,没有之一,通过对老鼠进行试验和研究。

伏隔核

药物成瘾是一种慢性、复发性脑病。成瘾药物与环境线索反复匹配所形成的长期病理性记忆是复吸的主要原因,消除此病理性记忆成为预防复吸的关键。记忆再巩固是指已经巩固的记忆再暴露于环境线索后被重新唤起,进入不稳定状态,经过再次巩固重返稳定状态的过程。再巩固为记忆修饰提供了一个重要窗口,也为消除成瘾记忆,预防复吸提供了可能。

 

伏隔核由核与壳部(nucleusaccumbensshell,AcbSh)构成,是奖赏环路的核心环节,研究显示,AcbSh对奖赏记忆形成有重要作用。氨基丁酸B型受体(GABAB受体)是治疗药物成瘾的潜在靶点,巴氯芬(baclofen,BLF)被认为是目前唯一可用于临床治疗成瘾的GABAB受体激动剂,但AcbShGABAB受体在记忆再巩固中的作用尚不清楚。目前,阻断记忆再巩固后的条件位置性偏爱(conditionedplacepreference,CPP)重建范式是评估消除成瘾记忆及预防复吸行为的主要行为学实验。本研究建立吗啡CPP小鼠模型,采用行为药理学方法观察双侧AcbSh灌注GABAB受体激动剂BLF对吗啡奖赏记忆再巩固及复吸行为的影响,为进一步理解药物成瘾的神经生物学机制,以及药物依赖的防治,特别是复吸行为提供新的思路。

 

实验动物及分组SPF级雄性C57BL/6J小鼠,6-8周龄,体重20-24克。自由摄食饮水,饲养温度20-25摄氏度,湿度30%-40%,光线昼夜循环12小时/12小时。实验前1周对小鼠进行抚摸,使其逐渐熟悉并适应实验人员的操作。

 

CPP实验仪器小鼠CPP实验使用Smart3.0小动物行为分析系统,实验箱外形尺寸:55cm乘14cm乘25cm,两个侧箱为规格相同的黑白箱,中间为灰色过渡箱。系统自动记录黑/白箱停留时间及百分比、总运动距离、运动轨迹追踪图像等资料。

 

适应环境期:允许小鼠箱间自由穿梭,每天1次,每次30分钟,共2天。预测试期(D0,Pre-C):箱内自由活动15分钟,确定小鼠自然偏爱倾向。将自然非偏爱侧作为伴药箱,另一侧为非伴药箱,剔除无明显偏爱小鼠。条件化期(D1-8,conditioning):封闭三箱间通道,分别于第2、6天上午,第4、8天下午腹腔注射吗啡(10毫升每公斤),置于伴药箱45分钟;第1、5天下午,第3、7天上午腹腔注射生理盐水(1毫升每公斤),置于非伴药箱45分钟。测试期(D9,Post-C)开放三箱间通道,检测15分钟内在各箱停留时间,计算小鼠对伴药箱的偏爱系数。

 

第10天(D10),动物随机分为6组:(1)激活+0.01BLF组(n=10)、(2)激活+0.06BLF组(n=12)、(3)激活+0.12BLF组(n=11)、(4)激活+生理盐水组(n=13)、(5)未激活+0.06BLF组(n=12)、(6)未激活+生理盐水组(n=12)。激活处理:将小鼠放入吗啡伴药箱,停留15分钟,唤起吗啡奖赏记忆。根据预实验及文献,双侧AcbSh微量灌注BLF剂量如下,0.01纳摩尔每0.2微升/侧,0.06纳摩尔每0.2微升/侧,0.12纳摩尔每0.2微升/侧,激活+生理盐水组注入0.2微升生理盐水。非激活处理:饲养笼取出小鼠,BLF注入0.06纳摩尔每0.2微升/侧或生理盐水,随后将小鼠放回饲养笼。复测CPP(D11/D24):吗啡奖赏记忆激活后第1天(PT-D1)和第14天(PT-D14),复测CPP。小剂量吗啡CPP点燃(D25,Priming):吗啡奖赏记忆唤起后第15天,小剂量吗啡(5毫克每千克)点燃,15分钟后检测CPP。

 

核团置管手术。小鼠麻醉后固定于脑立体定位仪上,牙科钻颅骨钻孔,根据小鼠脑图谱将长4mm的双管不锈钢引导套管(外径0.48mm,内径0.34mm,双管间距:1.5mm)植入双侧AcbSh上1mm处(AP:1.9mm,ML:±0.75mm,DV:−3.5mm),引导套管使用牙科水泥固定在颅骨上,并插入不锈钢帽(外径0.30mm)进行封闭。青霉素预防感染,术后恢复1周开始吗啡CPP实验等操作。

 

药物及微量注射药物及微量注射:盐酸吗啡注射液,浓度10毫克每毫升,每只动物腹腔注射10毫克每千克。BLF(溶于生理盐水,配制不同浓度的BLF溶液(0.01纳摩尔每0.2微升,0.06 纳摩尔每0.2微升及0.12 纳摩尔每0.2微升)。微量注射泵(WPI,nanoliter-2010)连接PE硅胶软管及注射内管(外径0.30mm,内径0.14mm),每侧注药02微升,速度382纳升每分钟,30秒完成注射。注药后留置内芯30秒,以保证充分扩散。拔出针芯,插入导管帽,封闭注药套管。

 

复吸是药物成瘾的主要特征,CPP作为研究精神依赖药物相关的环境线索的常用模型,为研究复吸提供了良好工具。记忆再巩固在环境线索诱导的复吸中起到关键作用。GABA是脑内奖赏环路的主要抑制性神经递质,其突触效应由两大主要受体介导:离子型GABAA受体以及代谢型GABAB受体,GABAA受体主要分布于突触后,GABAB受体突触前和突触后均有分布,二者在伏隔核中均有表达,有研究表明,AcbSh中的GABAA受体抑制性控制多巴胺介导的行为,而AcbSh中的GABAB受体对乙酰胆碱介导的行为施加抑制性控制。研究表明AcbShGABAA受体和GABAB受体同酒精成瘾密切相关,并且在AcbSh内灌注GABAA受体和GABAB拮抗剂均可减少酒精消耗。GABAB受体成为治疗成瘾、抑制复吸的特异性靶点之一。本研究结果显示,在吗啡奖赏记忆激活后AcbSh单次微量注入GABAB受体激动剂BLF(0.06纳摩尔每0.2微升/侧或0.12纳摩尔每0.2微升/侧)可以有效阻断吗啡奖赏记忆再巩固,长期抑制吗啡诱导的CPP,且小剂量吗啡激发后,亦未能重建吗啡CPP,提示奖赏记忆激活后激动AcbShGABAB受体有效防止吗啡的复吸行为。

 

本研究结果显示,在缺乏记忆激活的状态下,BLF注入AcbSh不能阻断吗啡奖赏记忆再巩固,究其原因可能是记忆再巩固假说的一个重要前提,记忆再巩固的阻断取决于记忆的重新激活。符合上述前提情况下,激活吗啡奖赏记忆后,此时该记忆处于不稳定阶段,激活AcbSh内GABAB受体可阻断吗啡奖赏记忆再巩固,进而消除吗啡CPP,小剂量吗啡点燃亦未能使CPP重建。反之,在缺乏记忆激活的状态下,巩固的成瘾记忆未能进入记忆不稳定阶段的再巩固,此时激活AcbSh内GABAB受体没有消除成瘾记忆作用。

 

吗啡奖赏记忆激活后,AcbSh内灌注BLF通过阻断奖赏记忆再巩固过程,进而长期消除吗啡CPP的分子生物学机制目前尚未完全明确。有研究显示其机制可能与Arc的表达调节有关。Arc是一种特殊的即早基因,不但能在神经活性刺激下迅速表达,且其蛋白产物会迅速移动、积聚于被激活的神经元突触,作用于神经元骨架,影响突触可塑性。同时Arc是多种记忆再巩固的重要分子生物学基础,包括恐惧记忆、空间记忆、物体识别记忆及成瘾奖赏记忆。成瘾记忆提取激活后,特异性提高了Arc蛋白表达,其对维持成瘾记忆再巩固发挥重要作用。有研究显示,GABABR激动剂可降低Arc蛋白表达;因此我们推测,吗啡奖赏记忆激活后,AcbSh内灌注BLF后,激动AcbShGABAB受体,可能通过抑制Arc表达增加,阻断了记忆再巩固,消除吗啡奖赏记忆,抑制吗啡CPP重建。

 

本研究证实,激活奖赏记忆后,AcbSh内单次微量注入BLF不影响小鼠的自主活动,提示单次核团内给予BLF没有出现其常见的镇静、肌肉松弛等副作用,这也排除了AcbSh注入BLF对吗啡奖赏记忆的消除作用是由于影响小鼠运动能力所导致的。

 

综上,本研究显示,AcbShGABAB受体在吗啡奖赏记忆再巩固中发挥着重要的作用。记忆激活后,双侧AcbSh内灌注GABAB受体激动剂BLF可阻断记忆再巩固,长期消除吗啡奖赏记忆,抑制吗啡复吸行为。

 

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